19 марта 2024
Подготовила Елена Клещенко
Сотрудники ИБХ РАН вместе с коллегами из других научных центров представили новый вариант биолюминесцентного репортера. В трансгенном растении экспрессируются гены гриба Neonothopanus nambi, причем один из ключевых генов заменен на более короткий ген мха Physcomitrella patens. Такой гибридный путь лучше подходит для широкого использования, чем описанный ранее, поскольку облегчает доставку генов в клетки хозяина с помощью вирусных векторов.
Изображение:
Светящаяся петуния с люциферазой гриба
Credit:
Light Bio, Inc | Пресс-релиз
Биолюминесцентные репортеры долгое время не находили широкого применения в растениях. Внедрение в растительные клетки люциферина дорого и может быть токсичным, а бактериальные люминесцентные системы недостаточно эффективны. Исследователи из Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН вместе с коллегами из других научных центров адаптируют метаболические пути люминесценции грибов для использования в растениях. В 2020 году они получили способные к люминесценции растения табака Nicotiana tabacum и родственного вида N. benthamiana.
В клетках трансгенных растений присутствуют гены ферментов гриба Neonothopanus nambi, отвечающих за биолюминесценцию: luz (его продукт — люцифераза), hisps (гиспидинсинтаза, или поликетидсинтаза I типа), h3h (гиспидин-3-гидроксилаза), cph (каффеоил-пируватгидролаза). Гиспидинсинтаза и гиспидин-3-гидроксилаза превращают кофейную кислоту (обычный метаболит растений, промежуточный продукт в биосинтезе лигнина) в гиспидин, а гиспидин в люциферин; люцифераза проводит собственно реакцию биолюминесценции, а каффеоил-пируватгидролаза замыкает цикл, снова превращая продукт этой реакции в кофейную кислоту.
Эта система не токсична для эукариот и не требует введения субстрата извне, однако для ее широкого применения необходима доработка. Гиспидинсинтаза требует посттрансляционной модификации (присоединения фосфопантетеина), поэтому может быть необходим пятый фермент, который проводит эту модификацию, если его нет у хозяина. Таким образом, общая длина ДНК, необходимой для экспрессии биолюминесцентной системы, достигает 12–17 т.п.н. Один только hisps имеет длину 5,1 т.п.н., а, например, векторы на основе РНК-вирусов могут доставлять в клетку участки генома не более 4 т.п.н.; емкость аденоассоциированных вирусов, применяемых для трансдукции ДНК в клетки животных, — около 4,7 т.п.н.
У растений есть компактные поликетидсинтазы III типа, способные проводить ту же реакцию, что гиспидинсинтаза гриба, при этом они примерно в четыре раза меньше и не требуют посттрансляционной модификации. В новой работе авторы заменили в биолюминесцентной системе гиспидинсинтазу гриба на растительную. Статья опубликована в ScienceAdvances.
Чтобы найти ферменты с подходящими свойствами, исследователи проанализировали данные о содержании их возможных продуктов в растениях. В итоге был найден 21 ген, потенциально способный проводить нужную реакцию. Эти гены экспрессировали в клетках дрожжей Pichia pastoris, которые также экспрессировали все гены, необходимые для биолюминесценции, кроме гиспидинсинтазы. Двенадцать из кандидатных генов восстановили способность к люминесценции в присутствии кофейной кислоты, причем 11 давали даже более сильную эмиссию света, чем фермент N. nambi.
После этого гены проверили в культурах клеток человека (HEK 293NT), табака и N. benthamiana. Биолюминесценция наблюдалась с 14 генами гиспидинсинтазы в растительных клетках и с семью — в клетках человека. Лучше всего себя показали во всех трех системах гены PzPKS2, HmS и PpASCL, причем PpASCL давал наиболее яркое свечение в растениях. Это ген мха Physcomitrella patens, его продукт участвует в биосинтезе спорополленина (компонента внешней стенки спор).
Все три растительных гена можно было доставлять в клетки с помощью вируса табачной мозаики, тогда как с геном гиспидинсинтазы гриба это не удавалось из-за его большого размера.
Наконец, авторы создали трансгенные линии N. benthamiana, в которых экспрессировались PpASCL, а также Luz, H3H и CPH гриба N. nambi. Растения люминесцировали, но на порядок слабее, чем линия с генами гиспидинсинтазы гриба и фермента для ее модификации. Причиной могла быть как низкая концентрация фермента PpASCL или его более низкая аффинность к субстрату, чем у «грибного», так и нехватка субстрата или специфическое ингибирование PpASCL метаболитами растения-хозяина. Дальнейшие эксперименты показали, что верно последнее предположение. Возможно, ингибирование флавоноидами поликетидсинтаз типа III в природе позволяет избежать накопления метаболитов в токсичных количествах.
С помощью подобных люминесцентных репортеров можно визуализировать invivo изменения активности генов, распространение инфекций. Очевидный недостаток автономной люминесценции как репортерной технологии — зависимость сигнала от экспрессии генов и от метаболической активности хозяина, отмечают авторы, однако замена грибного фермента на фермент растительного происхождения снижает количество узких мест. С другой стороны, подобный репортер подходит для мониторинга процессов, которые влияют на уровень метаболитов, ингибирующих люминесценцию, например, циркадных ритмов или развития растения.
На вопросы PCR.NEWS ответили двое из авторов работы — Илья Ямпольский и Надежда Мышкина (Маркина).
Расскажите, пожалуйста, о преимуществах системы биолюминесценции, заимствованной у грибов. Грубо говоря, зачем она нужна, если у нас есть люцифераза светлячка и GFP?
Основное преимущество биолюминесцентной системы грибов — ее автономность. Если для использования GFP всегда нужен внешний источник света, а для любой люциферазы — низкомолекулярный субстрат (люциферин), то автономная биолюминесцентная система приводит к свечению с использованием внутренних метаболитов того организма, с которым мы работаем. Если проводить параллели с обычной жизнью, то разница между системой грибов и люциферазой светлячка или GFP — как разница между обычным автомобилем и беспилотным: удобство для пользователя возрастает в разы, не надо ни обучаться вождению, ни нанимать шофера.
К слову, люциферазы бывают очень разные как по своему строению, так и по субстрату, окисление которого они катализируют. Наша лаборатория занимается поиском новых люциферинов и люцифераз из самого широкого круга светящихся организмов, причем для части люциферинов мы также близки к описанию пути их биосинтеза, так что, возможно, скоро будет становиться все больше автономных систем биолюминесценции. Тогда можно будет реализовать, например, разноцветное мечение организмов и решать сразу несколько научных задач в одном эксперименте.
И если говорить про цвет, то важно упомянуть, что природный цвет свечения грибов зелено-желтый, и именно он лучше всего проникает через растительные ткани, что тоже является важным преимуществом перед другими системами. Например, люминесценция светлячка ближе к желтому цвету, люминесценция целентеразин-зависимых люцифераз — к синему, а GFP, хоть и светится зеленым, для возбуждения флуоресценции требует синего света.
Наконец, еще преимущества системы биолюминесценции грибов — малый размер и низкая стоимость субстрата (молекулы кофейной кислоты). Даже если для усиления сигнала и потребуется добавлять кофейную кислоту извне, то она легче проникнет в клетку, а ее использование ненамного увеличит общую стоимость эксперимента по сравнению со стоимостью люциферина светлячка или целентеразина.
Даже лучшая гиспидинсинтаза растений, PpASCL, все же уступала «грибной» по интенсивности свечения в растении-хозяине, возможно, из-за ингибирования флавоноидами. Есть ли способы преодолеть эту проблему?
К сожалению, даже если такие способы и существуют, простых среди них точно нет. Во-первых, флавоноиды — довольно широкая группа веществ, поэтому сложно будет определить, все ли из них являются ингибиторами гиспидинсинтазы растений или только некоторые. Во-вторых, даже если мы и очертим круг молекул, которые мы бы хотели убрать из растительной клетки, это будет очень сложно осуществить технически. Практически каждый вторичный метаболит растения может быть синтезирован несколькими альтернативными путями: при блокировании одного из метаболических путей растительный организм может перераспределить ресурсы и синтезировать это вещество в таких же количествах, но другим способом. Если же заблокировать слишком много метаболических путей, это неизбежно скажется на жизнеспособности растения.
Возможно, проще будет решить проблему ингибирования с помощью направленной эволюции гиспидинсинтазы растений, чтобы снизить ее восприимчивость к ингибиторам, но эта задача тоже сложна технически, поскольку необходимо будет проверять очень много промежуточных модифицированных вариантов фермента, а для этого нужна растительная тест-система с высокой пропускной способностью. Тем не менее, все перечисленные трудности преодолимы в теории — возможно, нам удастся преодолеть их и на практике.
Эффективность в клетках млекопитающих пока «субоптимальная», но все же сигнал есть. Реально ли запустить растительный/грибной метаболический путь в организме млекопитающего?
Мы думаем, что это реально, однако это тоже потребует длительного оптимизационного процесса. Например, организм млекопитающего накладывает дополнительное ограничение по температурному оптимуму для всех ферментов: если растение можно выращивать при достаточно широких диапазонах температур и можно выбрать среди них самую выгодную с точки зрения работы ферментов, то организм млекопитающего сам будет поддерживать температуру, и наша задача — убедиться, что каждый фермент из биолюминесцентного пути при этой температуре не просто функционален, но и эффективен.
Другим ограничением является набор вторичных метаболитов в клетке млекопитающих: к нашему сожалению, среди них нет кофейной кислоты, поэтому ее биосинтез тоже необходимо наладить, добавив в систему еще несколько ферментов. Это, в свою очередь, увеличит нагрузку на клетку, поскольку ей необходимо будет экспрессировать ещк несколько генов (а нам эти гены надо будет выбрать и, возможно, тоже оптимизировать). Кроме того, мы не знаем, насколько мы сейчас далеки от функционального предела биолюминесцентной системы в клетке млекопитающего. Для растений этот предел ещё не достигнут, но уже позволяет создавать организмы, свечение которых видно невооруженным глазом, но это не дает нам гарантий про настолько далекую группу организмов, как млекопитающие. Мы допускаем, что создать настолько же ярких млекопитающих на базе биолюминесцентной системы грибов может быть невозможно, однако, разумеется, мы будем работать над этой задачей, пока в ней виден потенциал.
Несколько слов о компании Light Bio, где работают некоторые из авторов статьи. В ней действительно частное лицо может купить светящееся растение? Нет ли проблем с борцами против ГМО?
Да, действительно, в США сейчас любой желающий может заказать себе доставку светящегося растения. Сейчас принимаются предзаказы, а доставки начнутся в апреле. Некоторые покупатели отмечают, что цена растения очень привлекательная, а вот цена доставки высокая — впрочем, это их не остановило от покупки. Проблем с борцами против ГМО мы пока не испытывали. Отметим, что продукт компании Light Bio — Firefly Petunia — получил официальное свидетельство от профильного федерального агентства США USDA сертификат о безопасности. Мы верим, что все больше людей будет относиться к ГМО положительно и, возможно, светящиеся растения тоже сыграют в этом свою роль.
Для определения антител к SARS-CoV-2 используют вирусные белки со светящейся меткой
Источник
Kseniia A. Palkina, et al. A hybrid pathway for self-sustained luminescence // Science Advances. 8 Mar 2024. Vol 10, Issue 10. DOI: 10.1126/sciadv.adk1992
