19 апреля 2022
Рис. 1. Мицелий весёлки обыкновенной (Phallus impudicus) и результат его автоматического распознавания. Цвета соответствуют толщине гиф. Длина масштабного отрезка — 2 см. Рисунок из статьи L. Heaton et al., 2012. Analysis of fungal networks
Эколого-трофические стратегии грибов — сложная и запутанная тема в микологии: примерно про 90% всех описанных видов грибов толком не известно, чем они предпочитают питаться, с кем — сосуществовать и в каких условиях — жить. А ведь все это неплохо бы понимать при описании новых видов, оценке разнообразия биоценозов и в ряде других ситуаций. Новый подход к этой многолетней проблеме предлагается в совместной работе британских, немецких и финских ученых. Ее авторы смогли обнаружить, описать и интерпретировать визуальные паттерны растущих гиф грибов, которые могут быть автоматически распознаны созданной ими программой, способной предсказывать, какую экологическую стратегию использует тот или иной мицелий. Пока что это только демонстрация возможностей нового метода, но при дальнейшем развитии он существенно облегчит процесс установления экологической роли грибов в биоценозах.
Мицелий гриба представляет собой сложную сеть гиф, состоящую из ветвей и соединяющих их мостиков (анастомозов). Поскольку грибы сами по себе неподвижны, их способность захватывать территории и использовать имеющиеся на них полезные ресурсы обуславливается именно архитектурой такой сети. Значит, имея методику оценки строения мицелия, можно строить довольно правдоподобные гипотезы об эколого-трофическом поведении грибов. Этот широкий термин обозначает совокупность характеристик организма, связанных с питанием. В случае грибов имеются в виду трофические связи (паразитизм, хищничество, сапротрофное питание, микоризообразование), экологическая группа (ксилотрофы, гумусовые сапротрофы, микофилы и т. д.), предпочтения по обилию субстрата (эвтрофия, олиготрофия), а так же стратегии захвата субстрата (фаланга, партизанство), особенности регуляции синтеза ферментов и некоторые другие свойства. Все эти свойства в той или иной степени взаимосвязаны. Таким образом, проводя тщательный анализ, например, стратегии захвата субстрата или изучая строение гиф, можно с некоторой степенью достоверности определить и ряд других эколого-трофических характеристик.
Определение эколого-трофического поведения каждого вида грибов — довольно серьезная проблема: оно наверняка известно лишь у тех немногих видов, которые были тщательно изучены в лабораторных экспериментах и за которыми ученые наблюдали в природе. Остальным видам эколого-трофическое поведение в подавляющем большинстве случаев приписывается «по подобию» — по родственным филогенетическим связям с известными видами, по сходным экологическим нишам, а также по редко имеющимся данным о наличии генов, обуславливающих ту или иную стратегию. Таким образом, об экологии подавляющего большинства видов грибов микологи только «догадываются». В целом, более 90% всех описанных видов грибов имеет неизвестную экологическую стратегию и по умолчанию им приписывается роль почвенных сапротрофов за неимением лучшего варианта.
Вышедшее в начале этого года в журнале ISME Communications исследование подходит к решению описанной проблемы креативно: авторы посчитали, что если гриб питается за счет гиф, то, следовательно, его трофическое поведение обусловлено тем, как эти гифы устроены и ориентированы. Почему бы не найти способ проанализировать архитектуру мицелия и выявить взаимосвязь его строения с трофическим поведением?
Мицелий любого гриба можно представить в виде абстрактного графа, состоящего из узлов и ребер: гифы гриба представляют собой ребра, соединяющие узлы — кончики гиф, точки ветвления и анастомозы. Если представить мицелий в виде такого графа, то его можно будет исследовать с помощью широкого ассортимента математических инструментов. Чтобы это сделать, необходимо сперва получить в достаточном количестве изображения разнообразных мицелиев. С этой целью авторы взяли в работу мицелиальные грибы разных таксономических групп: из мукоромицетов (Mucoromycota) были выбраны представители родов Mortierella, Mucor и Umbelopsis, из аскомицетов (Ascomycota) — представители родов Fusarium и Alternaria, и, наконец, из базидиомицетов (Basidiomycota) — виды Resinicium bicolor, Phanerochaete velutina и Phallus impudicus (рис. 2). В исследовании участвовало по 3–4 штамма каждого из видов, ученые выращивали по три колонии каждого штамма.
Рис. 2. Использовавшиеся в исследовании виды грибов, фотографии их мицелия и соответствующие графы. Рисунок из обсуждаемой статьи в ISME Communications
Грибы выращивались на голодном агаре (среде с минимальным количеством солей и без питательных веществ) с целью создать условия, в которых гриб будет интенсивнее проявлять поведение, направленное на поиск питательных веществ. Это необходимо для получения наиболее ярко выраженных черт присущей тому или иному грибу стратегии питания. Для каждой колонии авторы получили большую коллекцию микроскопических снимков в разных масштабах. Все снимки были сведены в единую библиотеку, которая после процедуры стандартной коррекции цвета, яркости и контраста загружалась в специальную программу, умеющую различать мицелий (эту программу создал один из соавторов обсуждаемой статьи, ознакомиться с ее описанием можно здесь). Программа оценивала толщину гиф на различных участках, определяла, где находятся узлы и ребра, и, в конечном итоге, выдавала граф, содержащий все важные характеристики мицелия в виде числовых координат узлов и наборов параметров, описывающих гифы. Полученный таким образом массив данных можно анализировать и подвергать статистической обработке. Но сначала необходимо выбрать характеристики, позволяющие внятно описывать разные типы мицелия.
Авторы опирались на предыдущие работы, посвященные измерениям мицелия, абстрактным фрактальным моделям, а также попыткам исследования взаимосвязей между «архитектурой» мицелия и моделями роста грибов или эффективности транспорта внутри гиф. Они посчитали, что мицелий удобно представлять в виде взвешенного графа (это один из основных «рабочих инструментов» в науке о сетях), разложив его на ключевые функциональные единицы: кончики гиф, точки ветвления мицелия и пересечения (анастомозы) можно считать узлами (nodes), а соединяющие их участки нитей мицелия — связями или ребрами (edges). Центральный узел, имеющий наибольшее количество связей с наименьшей средневзвешенной длиной до любого из других узлов, называется центром графа (или корнем, root).
Рис. 3. Пример микрофотографии мицелия (А), с помощью алгоритма распознавания трансформированной в граф (В), в котором ребра представляют гифы, а точки — узлы (зеленые точки — кончики; голубые — точки ветвления). Подписаны ключевые элементы соответствующего мицелию взвешенного графа. Рисунок из обсуждаемой статьи в ISME Communications
Затем в графе мицелия определили следующие ключевые параметры, необходимые для оценки эффективности транспорта питательных веществ (рис. 3 и 4):
1. Длина ребра, отражающая длину гифы между двумя узлами (Edge length).
2. Толщина концевого ребра — толщина гифы в средней точке между последней точкой ветвления и кончиком гифы (Tip edge width).
3. Толщина основного ребра — толщина гифы внутри мицелия (Main edge width).
4. Угол ветвления — угол между ребрами в точке ветвления (Branching angle).
5. Плотность реберного покрытия — сумма длин всех ребер, относительно покрываемой ими площади влияния (на рис. 3 область влияния показана светло-желтым; Edge length density).
6. Сетчатость — топологическая величина, базирующаяся на том, как часто количество анастомозов в анализируемом участке мицелия отклоняется от гипотетической полностью связанной сети (если бы между всеми узлами существовали все возможные точки соединения без пересечений). Эта характеристика неплохо описывает связанность графа (Meshedness).
7. Центральная (корневая) транспортная эффективность Reff — показатель ожидаемой эффективности (зависящей от количества возможных путей, длины кратчайшего пути и толщины ребер на каждом участке пути — чем короче и толще гифы (ребра), тем эффективнее транспорт на заданном участке) однонаправленного транспорта от центра колонии до любой ее точки (Root efficiency).
8. Транспорт от центра к кончику (RTeff) — похожая на Reff величина, отражающая эффективность однонаправленного транспорта от центра к любому из кончиков гиф (Root-tip efficiency).
9. Глобальная эффективность (Geff) — величина ожидаемой эффективности двунаправленного транспорта между любыми двумя точками колонии (Global efficiency).
10. Объем MST — величина, показывающая затраты на построение данного мицелия относительно гипотетического минимального остовного дерева (MST), которое максимизирует эффективность транспорта при минимальном гифальном объеме (Volume-MST).
11–15. Различные показатели характеристики устойчивости мицелия (по толщине, по длине, устойчивость случайного сегмента и т. д.), отражающие, сколько из общего числа ребер на участке нужно убрать, чтобы вполовину сократить долю мицелия, соединенного с центром колонии на том или ином участке пути. Этот показатель характеризует устойчивость эффективного транспорта мицелия к повреждениям, вызванным, например, грибоядными организмами.
Рис. 4. Характеристики графа мицелия, исследованные авторами. Рисунок из обсуждаемой статьи в ISME Communications
Первым делом был проведен анализ избыточности (Redundancy analysis, RDA), который позволяет выявить мультивариативную типовую ординацию (см. Ordination), или, выражаясь проще, оценить, насколько полученные характеристики колонии характерны для всего типа. В ходе анализа были созданы три основные модели. Модель №1 описывала только микроскопические сети (аксомицеты и мукоромицеты), Модель №2 описывала макроскопические сети. Эти две модели учитывали одновременно морфологию и архитектуру мицелия, поэтому их ординация позволяла оценить связь между ними. Модель №3 брала результаты первых двух моделей и оценивала только характеристики архитектуры для макро- и микросетей. Она использовалась авторами для описания сети независимо от ее абсолютного масштаба, то есть для сравнения изображений мицелия, полученных при разных увеличениях. С ее помощью они хотели проверить, существуют ли общие закономерности сетевой структуры при поиске пищи. Также на основе критерия Парето были определены «архетипы» мицелиев — наиболее экстремальные варианты архитектуры исследованных видов.
Первый и основной результат обсуждаемой работы таков: теперь в распоряжении микологов есть методика, позволяющая перевести реальный живой мицелий во взвешенный граф, который можно анализировать математически. При этом ординационный анализ избыточности позволил выявить характеристики, не зависящие от масштаба, что снимает ограничение на воспроизводимость метода только при строгом соблюдении того же масштаба. Также ученые получают возможность сравнивать макроскопические и микроскопические сети в одной и той же модели.
Авторы обнаружили, что фенотипы мицелия имеют отчетливые морфологические паттерны, что позволяет с определенной долей достоверности различать группы грибов между собой, основываясь исключительно на архитектуре мицелия. Это тоже очень важный результат, который может в будущем дать исследователям удобный инструмент для классификации неспорулирующих (стерильных) колоний, поскольку на настоящий момент морфологическая типизация микромицетов основывается исключительно на морфологии структур спороношения, а стерильные изоляты можно отличить друг от друга только по молекулярно-генетическим признакам.
Третьим важным результатом работы можно назвать то, что проведенный статистический анализ позволил обнаружить архетипы в архитектуре построения мицелия грибами. Первый архетип — мицелий с низкой глобальной эффективностью, но высокой корневой эффективностью. Такое сочетание достигается за счет малой избыточности сети, которая больше всего соответствует графу, являющемуся остовным деревом (MST): такой мицелий содержит мало анастомозов и пересечений и представляет собой широко расходящиеся из единого центра, разреженные и равномерно толстые гифы (рис. 5). Транспорт от любого из кончиков гифы к центру максимально эффективен, в то время как между разными кончиками транспорт имеет малую эффективность из-за отсутствия анастомозов между ними. При этом из-за низкого коэффициента ветвления у этого архетипа низкая устойчивость к периферийным повреждениям: из каждого узла есть лишь один возможный путь до других точек колонии через центр. Такой архетип в экспериментах был склонен формировать представитель рода Mucor.
Рис. 5. Каждая точка представляет колонию грибов в пространстве ординации. Синими точками показаны зигомицеты, красными — аскомицеты, зелеными — базидиомицеты. Вершины треугольника соответствуют архетипам в пространстве ординации. В каждой вершине изображен граф колонии, наиболее близкой к соответствующему архетипу. Самые значимые изменения в архитектуре происходят вдоль оси RDA1. Эта ось показывает градиент между высокой глобальной эффективностью и устойчивостью, но низкой корневой эффективностью, и противоположной картиной с низкой глобальной эффективностью и устойчивостью, но высокой корневой эффективностью. Разделение двух архетипов с высокой связанностью в левой части графика обусловлено умеренными различиями в глобальной эффективности: «верхний» архетип (близкий к Phanerochaete ventulina) иметь более высокую глобальную эффективность по сравнению со вторым архетипом. Рисунок из обсуждаемой статьи в ISME Communications
Два других архетипа противоположны первому — они имеют высокую глобальную эффективность, но низкую корневую эффективность. В этих случаях мицелий состоит из значительно разветвленных тонких гиф с большим количеством пересечений. Такая архитектура устойчива к повреждениям за счет избытка альтернативных путей транспорта через многочисленные анастомозы, а транспорт из одной точки колонии в другую максимально эффективен. При этом центр колонии имеет низкую эффективность транспорта из-за тонких гиф и высокую эффективность периферийного транспорта. К таким архетипам приближались Mortierella и Phanerochaete velutina. Разница между двумя разветвленными архетипами обусловлена различиями в глобальной эффективности (см. рис. 5).
Оценивая характеристики мицелиев (точнее, их графов) по разным параметрам, исследователи задавались целью найти основные различия в их строении, связанные с двумя принципиально разными стратегиями поиска пищи, которые принято называть «фалангой» и «партизанством». «Фаланга» — стратегия, подразумевающая широкий поисковой фронт гиф, наиболее эффективная для добычи равномерно распределенных ресурсов. «Партизанство» же характеризуется независимыми небольшими, разобщенными и вытянутыми поисковыми фронтами, лучше всего подходящими для поиска локальных богатых питательными веществами источников.
Полученные данные свидетельствуют о том, что эти стратегии поиска пищи хорошо координируются и по градиенту связанности сети и концептуально соответствуют обнаруженным архетипам. Разветвленные мицелии с высокой связанностью и хорошим периферическим током применяют стратегию фаланги, отдавая предпочтение эффективной эксплуатации занятой площади, а не разведке. А вот архетип с низкой связанностью концептуально соответствует партизанской стратегии (высокая эффективность однонаправленного тока, низкая устойчивость и стоимость строительства), в которой предпочтение отдается разведке, а не эксплуатации.
Это лишь малая часть выводов, которые можно извлечь из обсуждаемой работы. Созданный авторами алгоритмический подход к анализу мицелия, для которого им удалось найти удобные и простые (для машинного обсчета) модели, потенциально дает крайне гибкий инструмент для поиска аналогичных взаимосвязей между архитектурой мицелия и условиями среды. Текущее исследование представляет собой в первую очередь proof of concept с первыми значимыми результатами. В дальнейшем наверняка последуют работы, анализирующие изменения в архитектуре мицелия в зависимости от доступности питательных веществ, солености, присутствия фунгицидов, микопатогенов, бактерий, локализованных источников пищи и так далее.
Известно, что разработанная авторами методика имеет и свои ограничения. Например, плесень Mucor, отнесенная к первому архетипу, в реальных условиях может компенсировать недостатки малой связанности мицелия множеством альтернативных механизмов. Так, в ответ на повреждение она может образовывать перегородки или клееподобные белки. Также у нее есть способность к реинтеграции отделившегося мицелия и реконфигурации сети. Некоторые грибы борются с микофагами (основными источниками повреждений мицелия), снижая пищевую привлекательность мицелия: опята (Armillaria) добиваются этого за счет меланизации, утолщения клеточной стенки или образования тяжей ризоморф, а, например, Resinicium bicolor выделяет в мицелий неприятные на вкус оксалаты. Однако все эти вариации разнообразных подстроек под экологические условия совсем не отменяют того, что предлагаемый математический метод анализа архитектуры мицелия способен учитывать важные морфологические признаки. Исследователям необходимо лишь найти способ категорировать все эти эволюционные механизмы в терминах модели. В этом смысле модель авторов имеет практически бесконечное пространство для расширения с целью поиска более точных и специализированных архетипов экологического поведения.
Авторы, однако, подчеркивают, что модель пока еще ограничена двухмерным пространством и не может учитывать строение воздушного и погруженного в субстрат мицелия. Эти характеристики можно будет включить в расчеты после того, как ученые научатся хорошо автоматизировать получение тонких 3D-проекций в образцах грибного мицелия.
Источник: C. A. Aguilar-Trigueros, L. Boddy, M. C. Rillig & M. D. Fricker. Network traits predict ecological strategies in fungi // ISME Communications. 2022. DOI: 10.1038/s43705-021-00085-1.
Арсений Белосохов
