27 ноября 2018
Российские биологи идентифицировали все гены, ответственные за биолюминесценцию светящегося гриба. Воссоздание путей синтеза необходимых для этого компонентов — люциферазы и люциферина — в дрожжевых клетках заставило их излучать свет, видимый невооруженным глазом. Кроме того, авторы статьи в Proceedings of the National Academy of Sciences показали, что новая люцифераза из гриба отлично работает в качестве репортерного белка в бактериях, эмбрионах лягушки и опухолевых клетках при добавлении субстрата в среду.
Множество видов живых организмов способны испускать видимый свет за счет биолюминесценции. Светиться им позволяет фермент люцифераза, которая окисляет субстрат люциферин. Эти основные компоненты могут быть разными по структуре — так, всего известно около 40 биолюминесцентных систем, включающих семь различных семейств люцифераз. Тем не менее, полное описание системы свечения, то есть идентификация генов, кодирующих люциферазу и пути синтеза люциферинов, определение структуры этих компонентов, было сделано только для бактериальных систем.
Люцифераза активно используется в биотехнологии в качестве репортерного белка, так как свечение удобно детектировать. Чаще всего для этого используется люцифераза светлячка (например, мы рассказывали, как японские нейробиологи использовали модифицированную люциферазу для наблюдения за активностью нейронов в мозге животных). Однако в этих случаях субстрат, то есть люциферин, каждый раз нужно добавлять извне.
Ученые из Института биоорганической химии РАН под руководством Ильи Ямпольского изучают системы биолюминесценции, которые можно было бы воссоздавать в модельных организмах и заставлять их светиться самостоятельно без добавления субстрата (так, среди авторов статьи учредители компании Planta, которая занимается выращиванием генно-инженерных светящихся растений). Бактериальные системы для этого не подходят.
Светящийся гриб
Hans E. Waldenmaier & Cassius V. Stevani
Два года назад ученым удалось расшифровать химическую структуру компонентов пути синтеза люциферина из вьетнамского светящегося гриба Neonotopanus nambi и установить, что грибной люциферин это 3-гидроксигиспидин, который через несколько промежуточных стадий образуется из кофейной кислоты — обычного метаболита растений. Тем не менее, для воссоздания пути синтеза в других организмах необходимо было идентифицировать гены, кодирующие ферменты синтеза, и саму люциферазу гриба.Для решения последней задачи библиотеку всех генов Neonotopanus nambi экспрессировали в дрожжах, а на выросшие колонии брызгали люциферином. Из светящихся колоний выделяли ДНК и определяли последовательность грибного гена, ответственного за свечение. Оказалось, что грибная люцифераза кодируется геном nnLuz и не похожа на другие люциферазы, то есть представляет новое семейство.
Исследователи также полностью отсеквенировали геном Neonotopanus nambi и посмотрели, какие гены расположены по соседству с nnLuz. Среди соседей люциферазы они обнаружили два гена, предположительно кодирующих ферменты биосинтеза 3-гидроксигиспидина из кофейной кислоты. Когда эти гены вместе с геном люциферазы и геном еще одного, уже известного фермента, экспрессировали в дрожжах, такие дрожжи оказались способны светиться в темноте (при условии, что в среду добавляли кофейную кислоту, так как сами дрожжи ее не синтезируют). На следующем этапе в полученные модифицированные дрожжи дополнительно встроили три гена синтеза кофейной кислоты из тирозина, в результате чего они уже смогли светиться самостоятельно, без добавления субстратов.
Свечение грибной люциферазы в дрожжах (А), в клетках человека (B), в опухоли мыши (C), в эмбрионе лягушки (D)
Alexey A. Kotlobay et al / PNAS 2018
Чтобы проверить, можно ли грибную люциферазу использовать в качестве репортерного белка в других клетках, исследователи проверили ее работу в бактериях, эмбрионах шпорцевой лягушки и клетках человека. Кроме того, ее сравнили с уже использующейся в биологии люциферазой светлячка по способности «метить» опухолевые клетки в организме мыши, и выяснили, что люцифераза гриба работает не хуже. Таким образом, ученые не только раскрыли генетическую основу биолюминесценции грибов, но и показали применимость найденной системы в биотехнологии и биомедицине. Исследование биолюминесценции грибов началось в красноярском Институте биофизики СО РАН с участием Нобелевского лауреата Осаму Шимомура, который открыл зеленый флуоресцентный белок медузы. Довести работу до логического завершения удалось уже под руководством Ямпольского в ИБХ РАН. В работе также приняли участие ученые из Австрии, Испании, Бразилии, Англии и Японии.Дарья Спасская
